討論
碳水化合物的利用以及調節糖分解代謝的整體調控途徑與許多重要病原體的持久存在和毒力密切相關，包括變形鏈球菌、化膿性鏈球菌和肺炎鏈球菌。口腔的微生物群落包含數百種細菌系統型，依賴于這些生物膜中有限營養物質的細菌之間存在激烈的種間競爭。口腔共生菌和口腔病原體之間的相互作用對于決定牙菌斑的“健康”或“致病”狀態至關重要。雖然在大多數低G+C革蘭氏陽性菌中，CcpA及其輔阻遏物HPr-Ser-P是CCR的主要效應物，但CcpA非依賴性CCR在變形鏈球菌中主導著多種分解代謝途徑的調節，包括fruAB、levDEFG以及纖維二糖和乳糖操縱子。這些在變形鏈球菌中的觀察結果提出了一個問題：這種病原體中CCR的進化是變形鏈球菌獨有的，還是可能反映了以口腔組織為自然棲息地的生物體在CCR控制上的普遍分歧？從本研究來看，至少一種豐富的共生菌以與變形鏈球菌相似的方式調控兩個同源的CCR敏感操縱子的表達，但在ManL和CcpA調節碳水化合物利用的作用方面存在一些顯著差異（圖4）。
本研究中構建的各種突變體的表征證明了fruA、levDEFG和manL的表觀同源物在變形鏈球菌和戈登氏鏈球菌之間的功能和調控具有高度保守性。與變形鏈球菌中的發現相似，FruA是戈登氏鏈球菌利用果糖聚合物所必需的，而levDEFG操縱子主要負責果糖的內化。也與變形鏈球菌相似，EIIMan的底物似乎包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖，甚至果糖。重要的是，變形鏈球菌中表達fruA和levDEFG操縱子所必需的LevQRST系統在戈登氏鏈球菌中序列和功能都是保守的。具體來說，失活levR基因（編碼該四組分信號轉導系統的響應調節器）導致誘導底物對兩個操縱子的完全激活喪失（數據未顯示）。因此，這些模型基因及其調控元件的高度保守性使得能夠可靠地對比兩種生物之間的CCR調控途徑。
許多研究支持CcpA在戈登氏鏈球菌的分解代謝物抑制和碳水化合物依賴性基因表達調節中的作用，并且已證明CcpA可以結合該生物體中的CRE序列來影響靶基因的轉錄變化。這些包括CCR敏感的精氨酸脫亞胺酶(AD)基因，它們在葡萄糖存在下被緊密抑制。CcpA的失活導致AD表達對葡萄糖敏感性的顯著喪失，刪除arcA基因5'端的CRE序列也是如此，支持經典的CcpA依賴性基因表達途徑在戈登氏鏈球菌中是有功能的。戈登氏鏈球菌中CcpA介導的葡萄糖依賴性基因表達調節的其他例子包括淀粉酶結合蛋白A基因(abpA(41))。相比之下，雖然CcpA的缺失對變形鏈球菌的基因表達有全局性影響，但僅在非常特定的體外條件下證明了ccpA突變體中對基因CCR的微小影響。否則，沒有證據表明在誘導和抑制底物組合存在下生長時，ccpA突變體中CCR得到緩解，無論是在基因表達水平還是通過評估突變菌株的二次生長。這一陳述也適用于變形鏈球菌的胍丁胺脫亞胺酶(AgD)途徑。AgD系統在生化方面和表達調控上與戈登氏鏈球菌的AD途徑高度相似，兩者都需要底物誘導并且對CCR敏感。然而，與戈登氏鏈球菌中的AD基因不同，變形鏈球菌中CcpA的失活并未緩解AgD基因表達的CCR。
盡管我們能夠創造出可以證明CcpA對fruA和levD表達產生影響的條件，但在戈登氏鏈球菌中這些基因啟動子區域附近缺乏CRE序列意味著觀察到的CcpA對這些操縱子的微小影響是間接的。相比之下，變形鏈球菌中fruA的表達可以通過CcpA結合fruA啟動子附近的兩個CRE來控制。本文提供的工作首次證明CcpA非依賴性CCR在口腔共生菌響應碳水化合物的基因調節中起主要作用。具體來說，刪除manL對二次生長的影響最為深遠，并導致在所有測試的碳水化合物中fruA和levD的高水平表達。值得注意的是，戈登氏鏈球菌中ccpA的失活導致fruA和levD操縱子的表達水平降低。我們的數據證明CcpA對抑制的影響可以在ManL缺陷型菌株中被消除，并且使用mRNA測量和基因融合證明CcpA抑制manL表達，表明CcpA對levD和fruA轉錄的影響幾乎完全歸因于CcpA在manL負向調節中的作用。ManL效應CCR的機制尚未明確確定，但現有證據表明，與調節蛋白的變構相互作用或涉及ManL以及可能的其他PTS組分的磷酸中繼可能是ManL依賴性CCR的潛在機制。
本研究的另一個重要發現是，在ccpA突變體中觀察到Ser46磷酸化HPr蛋白的量急劇增加。將manL突變引入ccpA突變體菌株逆轉了這種效應，雙突變體的Ser-46-HPr水平較低，但總體HPr蛋白水平（圖3）高于野生型菌株。由于在ccpA突變體中fruA和levD基因的CCR增強，而在ccpA manL背景中被消除，這一發現提出了HPr-Ser-P也可能是戈登氏鏈球菌中這些模型基因的CcpA非依賴性CCR效應物的可能性，類似于我們最近在變形鏈球菌中的報道。我們提出ManL和HPr-Ser-P都參與戈登氏鏈球菌的CCR，因為單獨刪除manL并未引起HPr-Ser-P水平的任何變化（圖3）。此時不能排除ManL通過調節HPr基因ptsH的表達和活性來影響CCR的可能性。然而，我們實驗室先前報道，在變形鏈球菌的manL突變體中可以觀察到ptsH和ptsI(EI)基因表達的altered expression。
本研究還揭示了變形鏈球菌和戈登氏鏈球菌之間CCR調節的另一個重要差異。在變形鏈球菌中，通過PTS滲透酶施加的CCR顯示出明顯的糖特異性，當存在各個滲透酶的同源或偏好碳水化合物時，對CCR的影響更大。例如，EIIABMan主要在葡萄糖和甘露糖存在時賦予CCR，這與其在葡萄糖和甘露糖攝取中的作用一致，而FruI和EIILev僅在其偏好底物果糖存在時有效施加CCR。因此，有人提出，未磷酸化的EII蛋白（當EII參與傳入碳水化合物的磷酸轉移時存在）通過變構相互作用調節轉錄激活因子LevR的活性，從而控制fruA和levDEFG的表達。在戈登氏鏈球菌中，ManL依賴的CCR似乎對生長碳水化合物的性質相對不敏感。例如，在葡萄糖、果糖、半乳糖或甘露糖存在下，fruA和levD的表達在manL突變體背景中相似地升高（表3和4）。一個可能的解釋是，這種觀察源于戈登氏鏈球菌中EIIMan復合物比變形鏈球菌具有更廣泛的底物特異性。特別是，PTS測定（圖2）表明ManL可能參與葡萄糖、甘露糖和半乳糖的轉運，并且在manL突變體中果糖-PTS活性略有增加，這可能是由于LevDEFG復合物表達升高所致。由于manL突變體在果糖上也生長較慢，因此ManL也可能內化果糖。相應地，在manL突變體生長于菊粉（必須水解成果糖才能被細菌利用）時，fruA和levD的表達增強。因此，戈登氏鏈球菌中CCR對特定糖源的相對獨立性可能與ManL在戈登氏鏈球菌中比在變形鏈球菌中有效內化更多底物的能力有關。值得注意的是，在甘露糖上生長的manL突變體中fruA和levD基因的表達水平幾乎與菊粉上相同，這可能是由甘露糖通過果糖/甘露糖特異性酶II LevDEFG復合物在manL突變體中轉運所誘導的。不過需要強調的是，ManL的缺失也可能導致利用多種偏好糖的能力降低，這可能導致糖酵解中間體減少，進而導致HPr-Ser-P水平降低。雖然情況似乎并非如此（圖3），但不能排除ManL缺陷的影響部分源于HPr的量或磷酸化狀態的改變。
本研究揭示的口腔鏈球菌CCR復雜性的另一個維度是ManL影響其自身操縱子表達的能力。因此，編碼EIIMan滲透酶的manL操縱子的抑制受CcpA和ManL共同控制。基于本文描述的實驗以及我們對變形鏈球菌的研究，似乎當碳水化合物濃度相當高（3至5 mM）時，CcpA可能會抑制manL和其他基因。
在這種情況下，經典的CcpA模型將適用，即細胞監測碳水化合物通過糖酵解途徑的流量，通過ATP依賴的HPr激酶調節HPr-Ser-P的量。在較低的碳水化合物濃度下，ManL可以響應其細胞外底物的可用性來調節其自身的產生以及其他滲透酶的水平，通過不過量生產轉運蛋白來節省能量。這種雙層調節系統（圖4）可能是在口腔細菌中進化而來的，并且應該非常適應口腔細菌所面臨的環境，即長時間依賴于從糖蛋白釋放的低濃度多種碳水化合物，其間穿插著現代飲食中常見的高濃度偏好碳水化合物。我們提出，口腔共生菌戈登氏鏈球菌和口腔病原體變形鏈球菌在調節偏好碳水化合物分解代謝方式上的這些細微差異反映了一種生態位適應，這可能使共生菌在有利于牙齒健康的條件下具有競爭優勢，而變形鏈球菌在促進致齲菌群和齲齒出現的條件下更有效地優化糖的利用。未來的研究將更詳細地檢驗這一假設。