摘要
口腔共生鏈球菌在口腔生物膜形成中起著關鍵作用，并通過與致病菌（如變形鏈球菌）競爭和拮抗其生長來促進牙齒健康。共生鏈球菌有效利用口腔中的多種碳水化合物對其持久定植至關重要，然而對這些生物體碳水化合物分解代謝的調控知之甚少。我們以豐富的口腔共生菌戈登氏鏈球菌DL1株為模型，利用外切-β-D-果糖苷酶基因(fruA)和一個果糖/甘露糖糖：磷酸轉移酶系統(PTS)酶II操縱子(levDEFG)作為模型系統，研究了其碳水化合物分解代謝物抑制(CCR)。功能研究證實了FruA和LevD在戈登氏鏈球菌中的預測作用。ManL，一種果糖/甘露糖型酶II PTS滲透酶的AB結構域，參與了葡萄糖、甘露糖、半乳糖和果糖的利用，并對fruA和levD操縱子的CCR施加主要控制。與變形鏈球菌不同，ManL依賴的CCR不是糖特異性的，并且半乳糖在戈登氏鏈球菌中能非常有效地引發CCR。戈登氏鏈球菌中明顯的ccpA同源物的失活實際上增強了對fruA和levD的CCR，這種效應可能源于其已證實的對manL表達的抑制作用。因此，口腔病原體變形鏈球菌和口腔共生菌戈登氏鏈球菌在CCR控制機制上存在一些相似性和根本性差異，這可能最終被用來增強健康相關共生菌在口腔生物膜中的競爭力。
引言
人類口腔提供了一個復雜而豐富的營養源，支持著多種微生物的生長，目前已在口腔中檢測到超過750種細菌系統型。然而，相對較少的屬占據了種群的大部分，口腔鏈球菌是人類口腔最早的定植者和最豐富的居民之一。口腔共生鏈球菌包括血鏈球菌群、唾液鏈球菌群、米氏鏈球菌群和咽峽炎鏈球菌群的成員，其中許多與牙齒和牙周健康相關。相比之下，人類齲齒的主要病原體變形鏈球菌通常不在健康牙齒組織上占顯著比例。相反，當宿主的飲食過度富含碳水化合物時，這種微生物會大量繁殖，這在很大程度上是由于其與許多共生鏈球菌相比，具有更強的產酸和耐酸能力。值得注意的是，許多口腔共生鏈球菌可以通過產生過氧化氫和其他抑制性物質來抑制變形鏈球菌的生長。由于人們普遍認識到齲齒具有生態學基礎，因此全面了解共生菌用來獲得相對于致齲微生物的選擇性優勢的機制，將有助于合理設計技術，以阻止不良生物的定植和致病。
碳水化合物是鏈球菌屬生長的主要能量來源，它們缺乏完整的呼吸鏈。雖然有一些鏈球菌通過ABC轉運蛋白或同向轉運系統內化碳水化合物的例子，但攝取碳水化合物的主要高親和力、高通量途徑是磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)依賴的糖：磷酸轉移酶系統(PTS)。PTS由通用組分酶I(EI)和組氨酸磷酸載體蛋白(HPr)，以及一系列底物特異性酶II(EII)復合物組成。EI催化PEP對HPr的His15進行磷酸化，隨后磷酸基團轉移到PTS滲透酶的EIIA結構域，然后到EIIB結構域，接著是膜相關EIIC結構域介導的單糖或二糖的內化和并發磷酸化，對于某些滲透酶，有時還涉及EIID結構域。與大多數細菌一樣，當存在快速代謝的碳水化合物時，鏈球菌中利用非偏好碳水化合物的基因會受到抑制。因此，碳分解代謝物抑制(CCR)在這些細菌中很常見，使生物體能夠優化能量生成。
大多數低G+C含量革蘭氏陽性菌中CCR的主要途徑涉及PTS的HPr和分解代謝物控制蛋白A(CcpA)，后者結合在CCR敏感基因啟動子區域的分解代謝物響應元件(CRE)上并調節其轉錄。CcpA的DNA結合活性通過與其Ser46磷酸化形式的HPr(HPr-Ser-P)相互作用而增強，并且在某些情況下可以被某些糖酵解中間體（如果糖-1,6-二磷酸）的存在所刺激。盡管變形鏈球菌中的CcpA同源物可以影響中心碳代謝的調節，但CcpA在變形鏈球菌的CCR中并不起主導作用。相反，HPr-Ser-P和三種EII復合物(EIIABMan,FruI和EIILev)在轉錄和轉錄后水平上對非偏好碳水化合物的轉運和分解代謝施加主要控制。
口腔共生鏈球菌和變形鏈球菌的代謝途徑、營養需求和基因組結構相似，因此它們可能在口腔中競爭共同的營養物質。作為最豐富的口腔共生菌之一和口腔的早期定植者，戈登氏鏈球菌在口腔生物膜形成過程中與各種口腔細菌相互作用，并能夠拮抗變形鏈球菌的生長。值得注意的是，變形鏈球菌和戈登氏鏈球菌在CCR調節方面已經存在一些明顯差異。特別是，雖然CcpA在變形鏈球菌的CCR中不占主導地位，但戈登氏鏈球菌的ccpA突變體顯示精氨酸脫亞胺酶途徑的CCR喪失，淀粉酶結合蛋白表達異常，以及青霉素耐受性喪失。如果口腔共生菌和變形鏈球菌確實以根本不同的方式管理CCR，那么或許可以設計出能夠破壞變形鏈球菌持久存在能力而不干擾共生菌生長的治療方法。使用我們在變形鏈球菌和戈登氏鏈球菌中顯示具有相似功能的兩個CCR敏感模型系統，我們證明了這些競爭性微生物在碳水化合物分解代謝的整體調控上存在核心相似性和顯著差異。
材料與方法
細菌菌株和培養條件。本研究中使用的野生型戈登氏鏈球菌DL1株及其衍生株在腦心浸液肉湯(BHI;Difco Laboratories,Detroit,MI)中于37°C、5%CO2和95%空氣條件下維持，必要時添加以下濃度的抗生素：卡那霉素(1.0 mg ml?1)、紅霉素(10μg ml?1)和壯觀霉素(500μg ml?1)。用于氯霉素乙酰轉移酶(CAT)測定和測量生長速率的戈登氏鏈球菌培養物在含有指定量的葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖或菊粉的TV基礎培養基中制備。用于PTS測定的細胞在保持85%N2、10%H2和5%CO2的厭氧室中培養。所有化學試劑和抗生素均購自Sigma Chemical(St.Louis,MO)。使用Bioscreen C監測儀(Oy Growth Curves AB,Helsinki,Finland)生成戈登氏鏈球菌菌株的生長曲線，每30分鐘讀取一次讀數。大腸桿菌菌株在Luria-Bertani培養基中生長，需要時添加以下濃度的抗生素：卡那霉素(40μg ml?1)、紅霉素(300μg ml?1)和壯觀霉素(50μg ml?1)。
DNA操作。采用標準重組DNA技術構建質粒。所有限制性內切酶和修飾酶均購自Invitrogen(Carlsbad,CA)或New England Biolabs(Beverly,MA)，并按供應商推薦使用。使用購自Qiagen(Valencia,CA)的QiaQuick DNA純化試劑盒進行DNA純化。所有引物由Integrated DNA Technologies(Coralville,IA)合成。采用PCR連接誘變方法，用非極性紅霉素抗性標記替換fruA、levD和manL的編碼序列。為構建manL ccpA雙突變體，將ccpA的0.9-kbp內部片段通過PCR擴增并克隆到pUC19上。隨后將非極性壯觀霉素抗性盒插入ccpA基因的EcoRV位點，并通過感受態轉化將該突變引入manL突變體中。所有工程菌株均通過PCR和DNA測序進行驗證，包括確定用于重組的臂的染色體內容序列，以確保在目標基因之外沒有引入意外的突變。
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